聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

{{百科小圖片|bka1y.jpg|PCR流程}}　　
'''聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)'''(Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱'''PCR'''，是一種[[分子]][[生物學(xué)]]技術(shù)，用于放大特定的[[DNA]]片段?？煽醋魃矬w外的特殊[[DNA]]復(fù)制。
　
{{百科小圖片|PCR技術(shù).gif|PCR技術(shù)}}
==PCR原理==
DNA的[[半保留復(fù)制]]是生物進(jìn)化和[[傳代]]的重要途徑。雙鏈DNA在多種[[酶]]的作用下可以變性解鏈成單鏈，在[[DNA聚合酶]]的參與下，根據(jù)[[堿基]]互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以[[復(fù)性]]成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)[[引物]]，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

但是，[[DNA聚合酶]]在高溫時(shí)會(huì)[[失活]]，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。

發(fā)現(xiàn)耐熱[[DNA聚合酶]]--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的[[寡核苷酸]]引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR[[擴(kuò)增]]形成的雙鏈DNA[[解離]]，使之成為[[單鏈]]，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物[[結(jié)合物]]在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的[[基因擴(kuò)增]]放大幾百萬(wàn)倍?！　?　　
{{百科小圖片|PCR原理.jpg|PCR原理}}
==PCR步驟==
<b>標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步</b>：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：

現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq[[酶活性]]不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度?！　?　　
==PCR反應(yīng)特點(diǎn)==
（1）特異性強(qiáng)

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②[[堿基配對(duì)]]原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶[[基因區(qū)]]，其特異性程度就更高。

（2）靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(μg=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)[[靶細(xì)胞]]；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。

（3）簡(jiǎn)便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用[[同位素]]，無(wú)[[放射性]]污染、易推廣。

（4）對(duì)標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。　　
==PCR的循環(huán)參數(shù)==
1、預(yù)變性（Initial denaturation）：模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考[[試劑]]說(shuō)明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。　

2、循環(huán)中的變性步驟：循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。

3、引物退火（Primer annealing）：退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。

4、引物延伸：引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略。延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其[[衍生物]]的衍生設(shè)定為1min/kbp?！?
5、循環(huán)數(shù)：大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

6、最后延伸：在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。

{{百科小圖片|PCR儀器.jpg|PCR儀器}}　　
==PCR學(xué)習(xí)視頻==
<videoflash>http://v.youku.com/v_show/id_XNTI0NjU5Njg=.html</videoflash>
==參看==
*[[DNA]]
*[[基因]]
*[[DNA聚合酶]]
*[[醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)/聚合酶鏈反應(yīng)|《醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)基礎(chǔ)》- 聚合酶鏈反應(yīng)]]

[[分類:生物]][[分類:生物學(xué)]]
[[分類:醫(yī)學(xué)視頻]]