層析
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層析(chromatography)，待分離化合物在固定相和流動(dòng)相間進(jìn)行分布的技術(shù)。易被固定相吸引的成分，其流速較慢；反之易溶于流動(dòng)相不易進(jìn)入固定相的成分，其流速較快，因此各待分離物質(zhì)洗脫時(shí)先后有序得以分離。通常將固定相填裝柱中，這稱為層析柱。流動(dòng)相流經(jīng)層析柱，分段收集流洗液進(jìn)行檢測(cè)。
1855年，德國(guó)F.F.龍格將染料混合物滴于濾紙上，注意到不同顏色環(huán)的形成。1897年D.T.戴首先用填充石灰石的層析柱以分段分離粗石油制品。此后，不同性質(zhì)的層析技術(shù)不斷創(chuàng)建，應(yīng)用十分廣泛，不僅在生物活性物質(zhì)的分離、分析、純化、制備中不可或缺，臨床醫(yī)學(xué)中也可利用高效液相層析法檢測(cè)體液中含量極微、難以用一般化學(xué)方法分析的許多激素、維生素、代謝物、藥物和毒物等。
原理
按照待分離化合物與固定相／流動(dòng)相的相互作用性質(zhì)的不同，層析原理也各異。①吸附層析。待分離物質(zhì)被固定相吸附，然后用流動(dòng)相洗脫之，混合物中各成分洗脫次序的先后，決定于它在固定相中吸附的能力及在流動(dòng)相中的溶解度。常用的固相吸附劑有氧化鋁、活性炭、淀粉、羥磷灰石等。洗脫液多用苯、石油醚等有機(jī)溶劑，或緩沖鹽溶液。②分配層析。待分離物質(zhì)在兩種互不混溶的液相中進(jìn)行分配，其中一種液相束縛于惰性支持物上，成為固定相;另一液相則為流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，易溶于流動(dòng)相（不易溶于固定相）的物質(zhì)乃先行洗脫。常用的能束縛液相的惰性支持物有濾紙、硅膠、纖維素等。③凝膠過(guò)濾層析。由交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠等惰性介質(zhì)，制成不同孔徑的微小顆粒，懸浮成膠。當(dāng)待測(cè)物質(zhì)流經(jīng)層析柱時(shí)，分子小者可鉆入膠粒的小孔內(nèi)，在流洗過(guò)程中，流洗出來(lái)較晚;而分子大者不能（或不易）進(jìn)入膠粒的小孔內(nèi)，將隨流洗液較早地被流洗出來(lái)。因此層析柱可起到分子篩的作用。④離子交換層析。解離基團(tuán)結(jié)合在固定相中，在一定pH下帶一定的電荷（如陽(yáng)電荷）；待分離化合物中在此pH下帶有相反的電荷者（如陰離子），即可與之相互吸引而滯留，然后可改變流洗液的pH或離子強(qiáng)度以洗脫之。待分離化合物中的陰離子能被吸引滯留者，稱陰離子交換層析，反之則為陽(yáng)離子交換層析。新設(shè)計(jì)的聚焦層析，可按各蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同而一一分離之。⑤親和層析。利用抗原－抗體，酶與抑制物或配體與受體間的特異性的高度親和力，可以將一方（如抗體）結(jié)合于固定相中，用以分離相對(duì)應(yīng)的另一方（如相應(yīng)的特異抗原），然后通過(guò)改變流洗液的pH值及/或離子強(qiáng)度以解離特異性結(jié)合的物質(zhì)（如抗原）。
種類
可按以下四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分類：①按待分離化合物與固定相/流動(dòng)相的相互作用的性質(zhì)區(qū)分，可分成吸附層析、分配層析、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析、疏水相互作用層析、共價(jià)層析及聚焦層析等。②按固定相與流動(dòng)相狀態(tài)的不同，可分成固－液體系（如吸附層析）、液－液體系(如分配層析)及氣－液體系（即流動(dòng)相為氣相的氣相層析）。③按流洗壓力的不同，可分成常壓、中壓及高壓液相層析。④按固相支持物填裝方式的不同，填裝成柱者稱柱層析(見(jiàn)圖)，平鋪在薄板上者稱薄層層析。
自從高效液相層析問(wèn)世以來(lái)，層析技術(shù)獲得革命性的變化，不僅可在較短時(shí)間內(nèi)，高效、精細(xì)地分析微量物質(zhì)，還能快速分離純化較大規(guī)模的制備量。將高效液相層析與質(zhì)譜聯(lián)用，氣相層析與質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)，或?qū)游雠c電泳聯(lián)用，則效果更佳。
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