DNA重組技術(shù)
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DNA重組技術(shù)(DNA recombinant technology)，將不同來(lái)源的DNA片段共價(jià)整合到有復(fù)制功能的DNA中去的技術(shù)。又稱分子克隆。該重組的 DNA分子可在寄主細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)錄表達(dá)出與該外源性DNA相應(yīng)的信使RNA或蛋白質(zhì)。
DNA重組技術(shù)的主要步驟是：
① 選擇并分離能攜帶外源性 DNA的載體。常用的DNA載體有細(xì)菌質(zhì)粒(染色體外DNA)，或噬菌體DNA，如大腸桿菌質(zhì)粒CoLEI及pBR322;λ噬菌體及M13噬菌體DNA等，它們都能插入(或整合)一定長(zhǎng)度的外源性DNA片段，并能在寄主細(xì)胞中自我復(fù)制。
② 以限制性內(nèi)切酶特異性水解打開(kāi)載體的雙鏈DNA，使之具有特定的序列末端。不同的限制性內(nèi)切酶能識(shí)別并水解打斷雙鏈 DNA中的特定序列處，如限制性內(nèi)切酶ECoRI能識(shí)別下列結(jié)構(gòu)并加以水解切斷。
（打斷處）
↓
………GAATTC………
………CTTAAG………
↑
?。ù驍嗵帲?
③ 制備擬整合入質(zhì)粒中的外源性DNA片段(即“目的基因”)，使其末端與上述經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的載體DNA末端，具有互補(bǔ)的序列結(jié)構(gòu)，便于粘合。
④ 將該具有互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)的外源性DNA片段，通過(guò)連接酶整合入載體DNA中。若載體是質(zhì)粒，則在整合入外源性DNA片段后，仍重新連接成環(huán)狀質(zhì)粒。
⑤ 將此重組DNA引入寄主細(xì)胞中，使其復(fù)制和擴(kuò)增。常用的寄主細(xì)胞為大腸桿菌及酵母，近已發(fā)展到用高等植物細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這類寄主細(xì)胞業(yè)經(jīng)變異處理，使之喪失降解外源性DNA的能力。將載體DNA往氯化鈣及磷酸鈉處理，使成DNA-磷酸鈣微粒，就易被寄主細(xì)胞內(nèi)吞而轉(zhuǎn)染之。亦有用核內(nèi)注射法或高壓電膜擊穿法以引入載體DNA者。
⑥ 通過(guò)一定的方法篩選能復(fù)制此重組 DNA的細(xì)胞或菌落。篩選方法的基礎(chǔ)是質(zhì)粒上含有抗藥性基因，或利用該菌對(duì)某營(yíng)養(yǎng)素的依賴表型。將該篩選出來(lái)的細(xì)胞株克隆繁殖，即能不斷復(fù)制擴(kuò)增大量的該外源性重組DNA。
1972年，D.A.杰克遜成功地從兩種不同生物來(lái)源的DNA（病毒SV40分子及λ噬菌體分子），合成了第一個(gè)重組DNA分子。1973年S.科恩等成功地使重組DNA分子在寄主細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)。這為今后體外大規(guī)模生產(chǎn)某特種蛋白質(zhì)的基因工程的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，使不少人體中含量極微而十分重要的蛋白質(zhì)(如某些激素和因子)的生物合成，能體外實(shí)現(xiàn)，這對(duì)醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展具有劃時(shí)代的意義。如人胰島素、干擾素、乙型肝炎疫苗等已可用重組 DNA技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)。許多臨床診斷用的特異性基因探針，也可通過(guò)DNA重組技術(shù)的擴(kuò)增而獲得，從而使很多遺傳性疾病(如 β-地中海貧血等)及乙型肝炎等的診斷水平前進(jìn)了一大步。試用重組DNA進(jìn)行“基因治療”，將能補(bǔ)償某些病人對(duì)該基因的缺失，此項(xiàng)研究在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中已實(shí)驗(yàn)成功，應(yīng)用前景誘人。
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